Thời tiết











  Đào tạo Ngắn hạn - Tập huấn
Qui trình xét nghiệm chuẩn (SOP) nhuộm soi phát hiện AFB trong bệnh phẩm đờm

QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM CHUẨN (SOP) NHUỘM SOI PHÁT HIỆN AFB TRONG BỆNH PHẨM ĐỜM 


     1.  Phạm vi áp dụng
          Trung tâm y tế, bệnh viện.
 
     2.  Tiêu chuẩn trích dẫn
          Thường quy chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới.
 
     3.  Giải thích từ ngữ
          AFB: Acid Fast Bacillus (trực khuẩn kháng axít).
 
     4.  Nguyên lý
          Nhuộm Zielh-Neelsen được sử dụng cho nhuộm soi AFB. Chất nhuộm carbol fuchsin dưới tác dụng của nhiệt độ sẽ gắn hữu cơ với axit mycolic có trong vách tế bào vi khuẩn và không bị mất sau khi tẩy mầu và nhuộm với xanh methylene, tạo hình ảnh trực khuẩn bắt mầu hồng đỏ đặc trưng cho vi khuẩn họ Mycobacteria trong vi trường, khi soi đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học.
 
     5.  Hình ảnh soi kính vi khuẩn lao điển hình
          Hình ảnh vi khuẩn lao sau khi nhuộm soi dưới kính hiển vi thường, vật kính dầu độ phóng đại 1000 lần.
 
Hình 1. Hình ảnh vi khuẩn lao sau khi nhuộm soi dưới kính hiển vi

     6.  Phương pháp xác định

6.1.        Loại mẫu

Đờm.

6.2.        Thiết bị, dụng cụ

·         Thiết bị:

-          Cabin an toàn.
-          Bể nhuộm.

·         Dụng cụ:

-          Lam kính.
-          Đèn cồn.
-          Que phệt bệnh phẩm.
-          Túi đựng rác thải y tế.
-          Hộp đựng bông cồn dùng cho lau khử trùng dụng cụ.

-          Bông, gạc.

6.3.        Hoá chất, thuốc thử

·         Dung dịch nhuộm carbon fuchsin

Dung dịch A

                                    L.O.C. High Suds (Amway)         0.6 ml
                                    Nước cất                                   100 ml
                        Dung dịch B        
                                    Fuchsin                                     1 g
                                    Cồn ethyl tuyệt đối                     10 ml

·         Dung dịch cồn - axit 3%

                        Absolute ethyl alcohol                 95ml
                        Nước cất                                    2 ml
                        Acid Clohydric đậm đặc               3 ml

·         Dung dịch xanh Methylene 0,25%

            Xanh Methylene                          0.25 g
            Nước cất                                    99 ml
            Axit Acetic                                  1 ml
 

6.4.        Lấy mẫu, bảo quản mẫu và vận chuyển mẫu

Cách lấy mẫu bệnh phẩm
-          Chọn loại hộp miệng rộng, dùng một lần, làm bằng nhựa trong, không ròn, không dễ vỡ, và không rò rỉ.
-          Đưa bệnh nhân hộp đựng đờm đã gián nhãn, ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân, hướng dẫn cách đóng nắp đảm bảo bệnh phẩm không rò rỉ và yêu cầu không làm mất, mờ thông tin trên nhãn.

-          Hướng dẫn bệnh nhân hít thở sâu 2-3 lần, sau đó ho thật sâu từ trong lồng ngực và khạc đờm vào ống đựng đờm bằng cách đưa miệng ống vào sát miệng.

-          Quá trình lấy mẫu được thực hiện ở phòng có thiết bị thông gió.

-          Đảm bảo lấy được mẫu đờm đủ chất lượng và số lượng: 2-3ml đờm đặc, nhày. Nếu chưa đủ, yêu cầu bệnh nhân lấy thêm một mẫu đờm nữa.

-          Đưa bệnh nhân một ống đựng đờm khác đã gián nhãn và ghi thông tin bệnh nhân để lấy đờm vào sáng sớm. Yêu cầu bệnh nhân súc miệng sạch trước khi ho khạc đờm.

      Cách bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm

-          Nếu bệnh phẩm được lấy tại thực địa và chưa thể thực hiện xét nghiệm ngay, bệnh phẩm phải được chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 3-4 ngày.

-          Bệnh phẩm phải được giữ ở nhiệt độ lạnh hoặc mát trong hộp vận chuyển đặc biệt có khóa cài an toàn, chống rò rỉ, chịu va đập mạnh và được dán nhãn báo hiệu hộp luôn phải được đặt theo phương thẳng đứng (hình 2).
 
Hình 2. Nhãn báo hiệu độ vật phải được vận chuyển theo phương thẳng đứng  

 

6.5.        Các bước tiến hành

   Bước 1: Chuẩn bị dung dịch nhuộm bằng cách trộn 50ml dung dịch A với 5 ml dung dịch B để được dung dịch nhuộm.
  

Bước 2:  

-         Dùng lam kính mới, dán nhãn, ghi mã bệnh phẩm trên nhãn. đánh dấu vị trí phết bệnh phẩm bằng một vòng tròn bằng bút mực vào mặt dưới của lam kính;

 

-         Trong cabin an toàn, mở hộp bệnh phẩm, chọn vị trí đờm đặc, nhày, màu vàng, phệt và dàn đều bệnh phẩm vào mặt trên ở vị trí đánh dấu. Cố định bằng cách hơ qua lại 3 lần trên ngọn lửa đèn cồn hoặc đèn gas cháy nhẹ, mỗi lần 3-5 giây.
 

Bước 3: Đặt lam kính lên giá đỡ của bể nhuộm, phủ đầy bề mặt lam kính với carbon fuchsin.

                                         
     
           
Bước 4: Hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn hoặc đèn gas, đưa đi đưa lại chậm rãi đến khi dung dịch bốc hơi, để trong 5 phút. Giữ nhiệt độ không để sôi dung dịch carbon fuchsin, bổ xung thêm dung dịch nhuộm nếu dung dịch bị cạn đi.
 
Bước 5: Rửa lam kính với nước.

 
Bước 6: Rửa lam kính với cồn - axit 3% để tẩy mầu trong 1- 5 phút cho đến khi các vết nhuộm sạch đi.
 

 


Bước 7:
Rửa kỹ lam kính với nước và làm sạch các vệt nước đọng trên lam.

 

Bước 8: Phủ đầy bề mặt lam kính với dung dịch xanh methylene 0,25%, để trong 1 phút.

Bước 9: Rửa kỹ lam kính với nước. để ráo nước và soi dưới kính hiển vi, vật kính dầu. Đọc kết quả. Lưu lam kính xét nghiệm đến khi có yêu cầu hủy.

6.6.        Sơ đồ tóm tắt quy trình xét nghiệm 


6.7.        Đọc kết quả

Bảng hướng dẫn đọc kết quả nhuộm soi AFB

Số lượng AFB

Kết quả

Mức độ

Số vi trường cần kiểm tra

0

Âm tính

Âm tính

100

1-9/100 vi trường

Dương tính

Ghi số lượng vi khuẩn

100

10-99/ 100 vi trường

Dương tính

1+

100

1-10/ 1 vi trường

Dương tính

2+

50

>10/ 1 vi trường

Dương tính

3+

20

         
            6.8.       
Độ tin cậy
          
            Nếu kết quả dương tính, đ
ộ tin cậy của xét nghiệm nhuộm soi xác định AFB đạt 99%.

 

6.9.        Chú ý


Tiêu bản phải được giữ trong hộp bảo quản sau khi đã đọc kết quả để dùng cho việc đánh chất lượng sau này. Tiêu bản chỉ có thể hủy sau khi lưu trữ 6 tháng.

     7.  Báo cáo kết quả

Tên phòng xét nghiệm                                                              Mã số mẫu

PHIẾU TRẢ LỜI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM      

 1. Thông tin liên quan đến mẫu bệnh phẩm 

Loại bệnh phẩm: ..................................    Nơi gửi: ...........................................
Ngày lấy mẫu: ......................... ... Ngày nhận mẫu: ..........................................
Họ tên:..........................................Tuổi.................. Giới: Nam [   ]        Nữ [   ]
Địa chỉ: ..............................................................................................................

 2. Yêu cầu xét nghiệm .............................................

 3.  Kết quả soi trực tiếp

Ngày đọc

Tiêu bản số

Kết quả (+/-)

Phân loại kết quả dương

3+

2+

1+

Ghi số cụ thể


                                                                                  ..........................., Ngày.......tháng......năm 200          
                                                                                                   Trưởng phòng xét nghiệm

           8.    Kiểm soát chất lượng

8.1.        Kiểm soát chất lượng thuốc nhuộm

Thực hiện xét nghiệm kiểm tra chất lượng thuốc nhuộm sau mỗi lần pha bằng cách tiến hành nhuộm soi tiêu bản mẫu chứng dương và mẫu chứng âm.

8.2.         Các biện pháp tránh dương tính giả 
 
-          Chỉ sử dụng lam kính mới và không bị trầy xước. 
-          Luôn luôn sử dụng dung dịch carbol fuchsin đã qua lọc.
-          Không để dung dịch carbol fuchsin bị khô trong suốt quá trình nhuộm.
-          Không để dung dịch carbol fuchsin bị sôi trong suốt quá trình nhuộm.
-          Tẩy màu thật sạch với dung dịch cồn - axit.
-          Đảm bảo không lấy bệnh phẩm có lẫn thức ăn hoặc bất cứ tạp chất dạng sợi nào.
-          Không để dụng cụ nhỏ dầu chạm vào lam kính.
-          Không để vật kính chạm vào lam kính.
-          Đảm bảo dán nhãn và viết thông tin chính xác trên hộp dụng đờm, lam kính và phiếu xét nghiệm.
-          Ghi chép và thông báo kết quả chính xác.
8.3.        Các biện pháp tránh âm tính giả
 
-          Đảm bảo bệnh phẩm thu được là đờm, không phải nước bọt.
-          Đảm bảo số lượng bệnh phẩm tối thiểu 2ml.
-          Chọn phẩn bệnh phẩm đặc, nhày để phết kính.
-          Phệt bệnh phẩm đúng cách, không quá dày, không quá mỏng, hoặc quá ít.
-          Cố định lam kính đúng thời gian, không quá nhanh, không quá lâu.
-          Nhuộm với carbol fuchsin trong vòng 5-7 phút.
-          Không tẩy lam kính quá mạnh với dung dịch cồn - axit.
-          Soi mỗi lam kính ít nhất 5 phút, quan sát ít nhất 100 vi trường trước khi kết luận bệnh phẩm âm tính.
-          Đảm bảo dán nhãn và viết thông tin chính xác trên hộp đựng đờm, lam kính và phiếu xét nghiệm.
-          Ghi chép và thông báo kết quả chính xác.

     9.  Các yêu cầu về an toàn

-          Phết và cố định bệnh phẩm phải được thực hiện trong ca bin an toàn.
-          Trong quá trình làm việc không đưa tay ra khỏi cabin an toàn.
-          Chỉ đưa tay ra ngoài khi đã tháo bỏ găng tay.
-          Bất cứ vật muốn đưa từ trong ca bin an toàn ra ngoài đều phải lau khử trùng bề mặt với cồn 700.
-          Đổ cồn 700 lên bề mặt làm việc và lau sạch bằng bông gạc sau khi làm việc.
-          Sau khi được làm sach, để ca bin an toàn hoạt động 15 phút trước khi tắt.
-          Bật đèn tím khử trùng ít nhất 30 phút.

     10.  Chất thải phát sinh và phương pháp xử lý

-         Sau khi hoàn thành thí nghiệm, tất cả các dụng cụ trong cabin an toàn phải được lau khử trùng bề mặt trước khi đưa ra ngoài.
-         Ống đựng đờm, và các vật liệu bằng nhựa, hoặc gỗ, bông được cho vào túi rác thải y tế, lau khử trùng sạch bên ngoài túi, buộc kỹ, thay găng tay, cho túi rác thải vào một túi sạch buộc kỹ để đưa đi đốt hoặc hấp tiệt trùng trước khi vất bỏ.
-         Các dụng cụ bằng thủy tinh, kim loại được khử trùng bề mặt bằng cồn 700 và cho vào thùng khử trùng để đem hấp tiệt trùng và ngâm rửa để dùng lại. Trước khi dùng dụng cụ phải được hấp khử trùng một lần nữa ở nồi hấp khử trùng dụng cụ sạch.

     11.  Các tài liệu tham khảo
WHO Guidelines on Standard Operating Procedures for MICROBIOLOGYChapter 17 - Tuberculosis. (2006). 
 
Chi tiết bài viết download tại đây:  /uploads/Quitrinhchuan_nhuomsoiAFB.doc
 
 
                                                                                                          ThS. Nguyễn Thị Vân Anh
                                                                                                     PTN Mycobacteria - Khoa Vi khuẩn
                                                                                                       Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương
 
Tin tiếp theo









Hội Y học Dự phòng Việt Nam

Tạp chí Y học Dự phòng

Trung tâm Dịch vụ KHKT và YTDP

Tiêm chủng mở rộng QG
Quảng cáo














Thiết kế website