Thời tiết











  Đào tạo Ngắn hạn - Tập huấn
Qui trình xét nghiệm chuẩn (SOP) nuôi cấy phân lập vi khuẩn lao

QUI TRÌNH XÉT NGHIỆM CHUẨN (SOP) NUÔI CẤY PHÂN LẬP VI KHUẨN LAO

 
     1.  Phạm vi áp dụng 
          Trung tâm y tế, bệnh viện.
     2.  Tiêu chuẩn trích dẫn

          Thường quy chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới.
     3.  Giải thích từ ngữ
          L-J: Lowenstein-Jensen.
 
          MOTT: Mycobacteria Other Than Tuberculosis (Mycobacteria không lao).
     4.  Nguyên lý
 
          Bệnh phẩm sau khi được thuần nhất và khử nhiễm bằng NaOH, sau đó trung hòa với HCl và được nuôi cấy trên môi trường Lowenstein-Jensen để phân lập vi khuẩn lao.
     5.  Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn lao điển hình
          Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn lao điển hình có dạng sần sùi súp lơ, màu trắng đục, mọc chậm sau ít nhất 2 tuần.
 

           Hình 1. Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn lao điển hình

     6.  Phương pháp xác định

6.1.        Loại mẫu

Đờm.

6.2.        Thiết bị, dụng cụ

·         Thiết bị:
      -          Cabin an toàn.
-          Tủ ấm nuôi cấy.
-          Máy ly tâm ống falcon 50ml.
-          Máy lắc vortex.
-          Máy lắc ngang dùng cho ống falcon 50ml.
-          Cân cân bằng.
·         Dụng cụ:
        -          Giá đựng ống falcon 50ml. 
        -          Giá đựng ống nuôi cấy.
        -          Ống Falcon 50ml vô trùng.
        -          Lọ thủy tinh 5-10ml có nắp xoáy.
        -          Pipet Pasteur.
        -          Găng tay.
        -          Hộp đựng bông cồn dùng cho lau khử trùng dụng cụ.
        -          Bông, gạc.
        -          Can nhựa đựng pipet thải.
        -          Túi đựng rác thải y tế.
        -          Hộp nhựa đựng dung dịch cloramin đậm đặc đựng chất thải bệnh phẩm.
6.3.        Hoá chất, thuốc thử
      -          NaOH 4%.
      -          HCl 1M chứa 20ml 0.5 đỏ phenol/ 1 lít.
      -          Nước cất.
      -          Môi trường L-J.
      -          Que thử niacin.
      -          Nước nổi môi trường Chủng chuẩn M. tuberculosis H37Rv, M. avium.

6.4.        Lấy mẫu, bảo quản mẫu và vận chuyển mẫu

Cách lấy mẫu bệnh phẩm

-          Dùng ống Falcon thể tích 50ml để làm ống đựng bệnh phẩm đờm dùng cho nuôi cấy.
-          Đưa bệnh nhân ống đựng đờm đã gián nhãn, ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân, hướng dẫn cách đóng nắp đảm bảo bệnh phẩm không rò rỉ và yêu cầu không làm mất, mờ thông tin trên nhãn.
-          Hướng dẫn bệnh nhân hít thở sâu 2-3 lần, sau đó ho thật sâu từ trong lồng ngực và khạc đờm vào ống đựng đờm bằng cách đưa miệng ống vào sát miệng.
-          Quá trình lấy mẫu được thực hiện ở phòng có thiết bị thông gió.
-          Đảm bảo lấy được mẫu đờm đủ chất lượng và số lượng: 2-3ml đờm đặc, nhày. Nếu chưa đủ, yêu cầu bệnh nhân lấy thêm một mẫu đờm nữa.

Cách bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm

-          Nếu bệnh phẩm được lấy tại thực địa và chưa thể thực hiện xét nghiệm ngay, bệnh phẩm phải được chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 3-4 ngày.
-          Bệnh phẩm phải được giữ ở nhiệt độ lạnh hoặc mát trong hộp vận chuyển đặc biệt có khóa cài an toàn, chống rò rỉ, chịu va đập mạnh và được dán nhãn báo hiệu hộp luôn phải được đặt theo phương thẳng đứng (hình 2)
 

          Hình 2. Nhãn báo hiệu độ vật phải được vận chuyển theo phương thẳng đứng

6.5.        Các bước tiến hành
Chuẩn bị khu vực làm việc
-          Bật khởi động ca bin an toàn.
-          Lau khử trùng bề mặt làm việc với cồn 700.
-          Gắn túi đựng rác thải vào thành trong phía bên phải của ca bin an toàn.
-          Lau khử trùng can đựng pipet thải, hộp đựng chất thải bệnh phẩm đặt vào trong ca bin an toàn.
 
 Thuần nhất và khử nhiễm đờm
 
-         Cho một thể tích NaOH 4% vào ống falcon đựng đờm (Trong trường hợp bệnh phẩm không được đựng trong ống falcon 50ml, phải chuyển bệnh phẩm sang ống falcon 50ml). Đậy chặt nắp ống.
-          Lắc kỹ bằng máy lắc vortex đến khi đờm tan hoàn toàn (bước này phải làm thật kỹ. Môi trường nuôi cấy có thể nhiễm nấm khiến cho vi khuẩn lao không mọc được nếu đờm không hoàn toàn thuần nhất).
-          Lắc các ống bệnh phẩm trên máy lắc ngang trong 15 phút vận tốc 150 vòng/ phút.
 
 Tách cặn đờm
 
-          Bổ xung nước cất vô trùng tới khi tổng thể tích dung dịch trong ống đờm là 40ml.
-          Cân bằng các ống mẫu bằng cân cân bằng.
-          Ly tâm 13000 x g trong 15 phút.
-          Loại bỏ nước nổi.
 
 Nuôi cấy vi khuẩn lao
 
-          Trung hòa cặn bệnh phẩm bằng cách nhỏ từng giọt HCl 1M chứa đỏ phenol cho đến khi dung dịch ngừng đổi mầu. Lắc kỹ trong quá trình nhỏ.
-          Dùng pipet Pasteur cấy cặn bệnh phẩm lên 3 ống môi trường L-J.
-          Có thể dùng một phần cặn này cho nhuộm soi AFB.
-          Cấy chủng chuẩn.
-          Đậy vừa chặt nắp ống môi trường đã cấy sau đó mở ra nửa vòng.
-          Ủ các ống nuôi cấy trong tủ ấm 370C.
-          Vặn chặt nắp ống nuôi cấy sau 1 tuần để tránh làm khô môi trường.
 
 Thử nghiệm Niacin
 
-          Đối với ống môi trường có mọc khuẩn lạc vi khuẩn lao điển hình, tiến hành thử nghiệm niacin để loại trừ MOTT.
-         Tách 0,5ml nước nổi môi trường nhỏ vào lọ tủy tinh, đưa que thử niacin vào lọ, đậy nắp lọ, lắc nhẹ và quan sát quá trình chuyển mầu sau 20 phút.
-         Chứng dương và chứng âm là nước nổi nuôi cấy chủng M. tuberculosis H37Rv, M. avium được tiến hành kiểm tra song song với các ống thử nghiệm.
-          Kết quả dương tính nếu dung dịch nước nổi chuyển màu vàng và âm tính nếu không chuyển màu.
-          So sánh màu của các ống thử nghiệm với ống chứng dương và chứng âm để đọc kết quả.

6.6.        Sơ đồ tóm tắt quy trình xét nghiệm

 
 

6.7.        Đọc kết quả

-          Kiểm tra các ống nuôi cấy sau 1 tuần để phát hiện Mycobacteria mọc nhanh.
-          Tiếp tục kiểm tra các ống nuôi cấy sau 2, 4, 6, 8 tuần, ghi chép, báo cáo kết quả sau mỗi lần kiểm tra.
-          Loại bỏ các ống bị nhiễm nấm, môi trường bị hóa lỏng, môi trường đổi màu xanh đậm do quá axít.
-          Trường hợp ống nuôi cấy không bị nhiễm hoàn toàn vẫn duy trì theo dõi.
-          Nếu phát hiện các ống có khuẩn lạc điển hình xuất hiện trong quá trình kiểm tra, ghi lại hình dáng (trơn, bóng, xù xì, dẹt, hình vòm, dạng tua, mở rộng, trong hay đục), màu sắc, số lượng khuẩn lạc trong sổ theo dõi.
-          Khuẩn lạc M. tuberculosis điển hình có dạng sần sùi súp lơ, màu trắng đục, mọc chậm sau ít nhất 2 tuần.
-          Bệnh phẩm có kết quả nuôi cấy dương tính nếu có ít nhất một ống nuôi cấy dương tính.
-          Chỉ trả lời kết quả âm tính nếu các ống nuôi cấy của bệnh phẩm không có khuẩn lạc mọc sau 8 tuần.
-          Mycobacteria có thử nghiệm niacin âm tính, Mycobacteria mọc nhanh (ít hơn 7 ngày), Mycobacteria mọc chậm có khuẩn lạc màu vàng, cam, hồng được trả lời là MOTT.

6.8.        Độ tin cậy

Nếu kết quả dương tính, độ tin cậy của nuôi cấy phân lập vi khuẩn lao đạt 100%.

     7.  Báo cáo kết quả  

Tên phòng xét nghiệm                                                              Mã số mẫu: 

PHIẾU TRẢ LỜI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM     

 1. Thông tin liên quan đến mẫu bệnh phẩm

Loại bệnh phẩm: ..................................    Nơi gửi: ...........................................
Ngày lấy mẫu: ......................... ... Ngày nhận mẫu: ..........................................
Họ tên:..........................................Tuổi: ................. Giới: Nam [   ]        Nữ [   ]
Địa chỉ: ............................................................................................................

 2. Yêu cầu xét nghiệm .............................................

 3. Kết quả nuôi cấy

                                    Dương tính                      Âm tính                         Nhiễm
Sau 7 ngày                      [   ]                                 [   ]                               [   ]
Sau 2 tuần                      [   ]                                 [   ]                               [   ]
Sau 4 tuần                      [   ]                                 [   ]                               [   ]
Sau 6 tuần                      [   ]                                 [   ]                               [   ]
Sau 8 tuần                      [   ]                                 [   ]                               [   ]

 4. Kết quả định danh

[   ]   M. tuberculosis           
[   ]   MOTT  
[   ]   Loại khác: ...........................................
 
        
                                                                              ..........................., Ngày.......tháng......năm 200          
                                                                     Trưởng phòng xét nghiệm
8.    Kiểm soát chất lượng
8.1.        Kiểm soát chất lượng môi trường

Thực hiện xét nghiệm kiểm tra chất lượng môi trường bằng cách nuôi cấy chủng chuẩn vi khuẩn lao H37Rv ở nồng độ 106 vi khuẩn/ml, đồng thời với mẫu bệnh phẩm phân lập. Ống chứng âm không nuôi cấy vi khuẩn dùng để kiểm tra tính vô khuẩn của môi trường.
8.2.         Các biện pháp tránh dương tính giả 
 
-         Bệnh phẩm được xử lý ngay trong ống đựng bệnh phẩm. Tránh chuyển bệnh phẩm từ ống đựng sang ống khác khi xử lý.
-          Không mở cùng lúc nhiều hơn một ống bệnh phẩm.
-          Không mở cùng lúc nhiều hơn một ống môi trường.
-          Sử dụng pipet dùng một lần.
-          Loại bỏ nước nổi bệnh phẩm nhẹ nhàng tránh làm bắn dung dịch gây nhiễm ngược trở lại ống bệnh phẩm.
-          Sử dụng loại hộp đựng chất thải bệnh phẩm sâu lòng, miệng nhỏ.
-          Đảm bảo dán nhãn và viết thông tin chính xác trên ống đựng đờm, ống nuôi cấy và phiếu xét nghiệm.
-          Ghi chép và thông báo kết quả chính xác.
8.3.        Các biện pháp tránh âm tính giả
 
-          Đảm bảo bệnh phẩm thu được là đờm, không phải nước bọt.
-          Đảm bảo số lượng bệnh phẩm tối thiểu 2ml.
-          Đảm bảo bệnh phẩm hoàn toàn thuần nhất sau khi lắc bằng vortex.
-          Đảm bảo đúng thời gian khử nhiễm. Thời gian tổng cộng của khử nhiễm với NaOH và ly tâm không kéo dài quá 30 phút.
-          Loại bỏ nước nổi nhẹ nhàng sau ly tâm trách làm mất cặn vi khuẩn.
-          Dùng pippet đầu tip nhỏ để trung hòa bệnh phẩm với dung dịch HCl.
-          Dừng nhỏ dung dịch HCl ngay khi cặn bệnh phẩm dừng chuyển mầu.
-          Kiểm tra nhiệt độ tủ nuôi cấy thường xuyên.
-          Đảm bảo dán nhãn và viết thông tin chính xác trên ống đựng đờm, ống nuôi cấy và phiếu xét nghiệm.
-          Ghi chép và thông báo kết quả chính xác.

      9.  Các yêu cầu về an toàn

-          Xử lý bệnh phẩm phải được thực hiện trong ca bin an toàn cấp hai.
-          Quá trình thực hiện cần ít nhất hai người, một người thao tác, một người cung cấp dụng cụ sạch.
-          Trong quá trình làm việc không đưa tay ra khỏi cabin an toàn.
-          Chi đưa tay ra ngoài khi đã tháo bỏ găng tay.
-          Bất cứ vật muốn đưa từ trong ca bin an toàn ra ngoài đều phải lau khử trùng bề mặt với cồn 700.
-          Đổ cồn 700 lên bề mặt làm việc và lau sạch bằng bông gạc sau khi làm việc.
-          Sau khi được làm sạch, để ca bin an toàn cấp hai hoạt động 15 phút trước khi tắt.
-          Bật đèn tím khử trùng ít nhất 30 phút.
-          Trong quá trình đọc kết quả, nếu xảy ra sự cố rơi vỡ phải xử lý theo quy trình xử lý sự cố xảy ra với tác nhân gây bệnh nguy hiểm cấp 3.

     10.  Chất thải phát sinh và phương pháp xử lý

-         Sau khi hoàn thành thí nghiệm, tất cả các dụng cụ trong cabin an toàn cấp hai phải được lau khử trùng bề mặt trước khi đưa ra ngoài.
-         Bỏ tất cả các vật liệu hủy bỏ bằng nhựa vào túi rác thải y tế, lau khử trùng sạch bên ngoài túi, buộc kỹ, thay găng tay, cho túi rác thải vào một túi sạch buộc kỹ, dán nhãn biohazard và tem chỉ thị tiệt trùng để đưa đi đốt hoặc hấp tiệt trùng trước khi vất bỏ.
-         Các dụng cụ bằng thủy tinh, kim loại phải được khử trùng bề mặt bằng cồn 700 và cho vào thùng khử trùng để đem hấp tiệt trùng và ngâm rửa để dùng lại. Trước khi dùng dụng cụ phải được hấp khử trùng một lần nữa ở nồi hấp khử trùng dụng cụ sạch.

     11.  Các tài liệu tham khảo

WHO Guidelines on Standard Operating Procedures for MICROBIOLOGYChapter 17 - Tuberculosis. (2006). 
 
Chi tiết bài viết download tại đây:  /uploads/Quitrinhchuan_nuoicay phanlap vikhuanlao.doc
 
                                                                                                       ThS. Nguyễn Thị Vân Anh
                                                                                                  PTN Mycobacteria - Khoa Vi khuẩn
                                                                                                    Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương 
 
 
Tin tiếp theo









Hội Y học Dự phòng Việt Nam

Tạp chí Y học Dự phòng

Trung tâm Dịch vụ KHKT và YTDP

Tiêm chủng mở rộng QG
Quảng cáo














Thiết kế website